ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ "Рефракция 2009. Пресбиопия"ИМПЛАНТАТ АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ СИЛИКОВЫСУШЕННЫЙМатериалы по теме "Взаимосвязь гидродинамики и аккомодациии" готовятся к публикации на сайте. Обновление информации ожидается после 10 ноября 2008 года.
English  
О больницеУслуги и ценыАРТ-ВизиологияКонтакты

Силиковысушенная амниотическая мембрана с сохраненными клетками

Силиковысушенная амниотическая мембрана с сохраненными клетками эпителия для реконструкции поверхности глаза.

Е.С. Милюдин, д.м.н. А.В. Золотарев, д.м.н. Л.T. Волова, Ю.М. Ахмерова

Репаративная регенерация роговицы при различных патологических состояниях нуждается в создании определенных условий для усиления потенциала митотической активности региональных стволовых клеток. Поиск материалов, использование которых позволяет создать эти условия, привел к повторному открытию амниотической оболочки. Анатомическое строение, особенности тканевого состава и функции амниона определяет ряд качеств, наличие которых привлекает исследователей и клиницистов к использованию амниотической оболочки при лечении различных патологических состояний. Используемая для изготовления трансплантата внеплацентарная зона амниона выстлана кубическим эпителием. Эпителий амниона продуцирует гликопротеиды, интерлейкины, факторы роста. (Champliaud M.F., et.al., 1996,). Данные вещества усиливают пролиферацию, миграцию и дифференциацию стволовых клеток эпителия,  предупреждают эпителиальный апоптоз и угнетают развитие фиброза (Keelan J.A., et.al.,1997 Shimazaki J, et.al.,1997; Na B.K, et.al.,1998).

Особый интерес представляют содержащиеся в эпителиальных клетках ламинины. Наличие данных гликопртеидов обеспечивает адгезию к внеклеточному матриксу клеток регенерирующего эпителия.

Следовательно, слой эпителиальных клеток амниотической оболочки  и содержащиеся в данном слое активные протеиды имеют решающее значение в обеспечении условий для усиления потенциала митотической активности региональных стволовых клеток и успешной фиксации вновь образованного слоя эпителиальных клеток на поверхности роговицы.

Однако, использование нативной амниотической оболочки ограничено необходимостью предварительных исследований, возможностью инфицирования реципиента и краткосрочностью сохранности эпителия.

Эпителий амниона хорошо сохраняется в питательной среде при температуре +4°С в течение 6 – 7 дней с сохранением всех лечебных свойств амниотической оболочки.

При хранении амниотической оболочки замораживанием до –80°С через 6 месяцев в клетках эпителия амнона отмечаются пикнотические изменения в ядрах, их разрушение, появление полигональной формы клеток (Panda A. 1999, Mejia LF, et.al. 2001, Xu L, et.al., 2001). Дальнейшие исследования с последующим культивированием клеток криоконсервированной амниотической оболочки показали, что клетки эпителия амниона утрачивали способность к росту in vitro (Taylor, R. J., et.al.,1998).

Консервация с использованием лиофильной сушки и последующей стерилизацией гамма лучами амниотической оболочки изначально подразумевает сохранение только коллагеновой структуры. (Момозе А., et.al.,2001).

Однако нативная и криоконсервированная так же как и лиофилизированная амниотическая мембрана при фиксации её на поверхности глазного яблока обладает аналогичными лечебными свойствами (Tseng S.C., et.al.,1997; Момозе А., et.al.,2001).

Значительно более простым по сравнению с лиофилизацией является метод высушивания над силикагелем. Данный метод консервации, как и лиофилизация, не обеспечивает сохранности жизнеспособности клеток амниотической оболочки, следовательно, можно предположить сохранение уникальных свойств амниотической мембраны в нежизнеспособном эпителии.

Цели исследования. Определить степень сохранности эпителия АМ после предварительной обработки и консервации путем обезвоживания над силикагелем с последующей стерилизацией. Изучить эффективность клинического применения АМ консервированной в среде с сохраненным  жизнеспособным эпителием, и силиковысушенной АМ.

Материалы и методы. Произведено гистологическое исследование 18 образцов обработанного антибиотиками нативного амниона, и 18 тотальных плоскостных образцов амниона, консервированного силиковысушиванием и дополнительно подвергнутого стерилизации гамма лучами. Клинические исследования проводились на пациентах получивших тяжелые химические и термические ожоги. Под нашим наблюдением в течение 1999 – 2002г.г. находилось 18 человек (21 глаз) с тяжелыми ожогами роговицы и конъюнктивы глазного яблока. Все пострадавшие мужского пола, средний возраст 39 лет.  У 13 пациентов (15 глаз) поражение глаз было химическим, у 5 пациентов (6 глаз) поражение было термическим. Больные разделены на две группы. Для лечения 4 пациентов (5 глаз) первой группы использовалась АМ с жизнеспособными клетками эпителиального слоя. Для лечения 14 пациентов (16 глаз) второй группы использовалась консервированная методом высушивания над силикагелем АМ с нежизнеспособным эпителиальным слоем. До операции и в послеоперационном периоде больным производилась визометрия, биомикроскопия, цитограмма роговичного эпителия. Всем больным в течение первых 3-4 суток либо на 10-14 день после ожоговой травмы выполнялась стандартная процедура: некрэктомия, покрытие амниотической мембраной поверхности глазного яблока конъюнктивальных сводов силиковысушенной амниотической мембраной.

Технология консервации амниотической мембраны.

Технология получения донорского материала является стандартной, и осуществляется следующим образом. Забор участка плаценты производится в роддоме в стерильных условиях, при выполнении кесарева сечения у беременных женщин, с серонегативными результатами обследований на ВИЧ, гепатит В и С, сифилис.

В тканевом банке плацента очищается от сгустков крови в 0,9% растворе хлорида натрия. Амнион отделяется от остатков хориона. Амниотическая оболочка обрабатывается в растворе антисептиков, антибиотиков и в пластификаторе. Далее АМ фиксируется на специальных фиксаторах в виде рамок произвольных размеров. Нами использовались рамки размерами 40х40мм.  Амниотическая оболочка сохранялась в фиксированном положении до окончания процесса высушивания над силикагелем. В процессе консервации не наблюдалось изменения формы, структуры и окраски донорского материала. В последующем амниотическая мембрана упаковывалась в одноразовые полиэтиленовые пакеты фирмы “Wipak medical”и производилась её стерилизация  g-лучами с дозой 15кГр. Срок хранения консервированной таким образом амниотической мембраны не менее 2 лет, при комнатных условиях.

Результаты.

Детальное изучение нативного амниона показало наличие в нем пяти слоев: амниотический эпителий, базальная мембрана, компактный слой, слой фибробластов и спонгиозный слой (Van Herendael B.J., et.al., 1978).

Клетки эпителия в основном одноядерные, но встречаются и многоядерные. В клетках амниотического эпителия встречаются митозы (примерно 1 на 100 клеток). Клетки эпителия соединены мостиками, между которыми располагаются межклеточные щели.

При электронно-микроскопическом исследовании установлено; что диаметр межклеточных щелей равен 7 – 10 нм. Эти щели сообщаются с полостью амниона и внутриклеточными вакуолями они рассматриваются как межклеточные канальцы, участвующие в процессах обмена (Ю. В.Гулькевич et.al., 1968).

Базальная мембрана расположена под амниотическим эпителием и состоит из тонкой сети ретикулярных волокон. В подэпителиальном слое проходят кровеносные сосуды. К базальной мембране прилегает компактный слой, также состоящий из переплетающихся между собой и тесно расположенных ретикуляр­ных волокон. Слой фибробластов состоит из клеток, располагающихся в густой сети коллагеновых, ретикулярных волокон и межклеточного вещества. Среди клеток этого слоя встречаются митозы, имеются гистиоциты и клетки Кащенко – Гофбауэра.

Спонгиозный слой посредством соединительно-тканных волокон и межклеточного вещества связан с гладким хорионом. Он состоит из ретикулярных волокон, между петлями которых имеется жидкость.

Изучение гистологических препаратов силиковысушенной АМ подтвердило наши предположения о значительных изменениях в эпителиальном слое. Так, эпителиальные клетки выглядят уплощенными с гомогенной оксифильной цитоплазмой. Большинство ядер палочковидной или овальной формы с грубыми глыбками хроматина. В некоторых клетках можно наблюдать пикноз ядер, в отдельных клетках обнаруживаются околоядерные вакуоли. Ядра в таких клетках изменены-неправильной формы, поверхность неровная, с вмятинами и выступами. На единичных участках клетки лишены ядер. Базальная мембрана хорошо контурирует. Компактный  слой выглядит как гомогенная оксифильная полоса. В соединительнотканной части мы наблюдаем резкое уменьшение количества клеточных элементов. Нередко видны тени ядер. Ядра сохранившихся фибробластов имеют палочковидную форму. Сами клетки резко уплощены. Количество макрофагальных элементов тоже уменьшено, однако нам удалось наблюдать наряду с уплощенными клетками Кащенко-Гофбауэра нормальные неизмененные клетки. В этой зоне можно видеть продольно расположенные волокна и участки гомогенного оксифильного прокрашивания. Спонгиозный слой представляется более рыхлым, чем ранее описанный. В нем видны рыхло расположенные пучки извитых волокон, проявляющих слабую оксифилию. Между пучками волокон встречаются единичные фибробласты. Четкой границы между этими двумя слоями (фибробластов и спонгиозным) проследить  не удается.

Наблюдаемый кариопикноз в препарате свидетельствует о том, что эпителий амниона и макрофагальный ряд клеток теряют свою жизнеспособность после силиковысушивания. Следовательно, наряду с достаточно хорошим сохранением структуры, клеточного состава амниона, подвергнутого силиковысушиванию, нужно отметить нежизнеспособность  клеток его эпителия, фибробластов и уменьшение количества клеток во всех слоях. Однако в связи с сохранением структуры клеток, и плотной связи клеточных мембран эпителия с подлежащим слоем имеются основания для предположения о сохранении определенных свойств силиковысушенной АМ, характерных только для АМ с жизнеспособным эпителиальным слоем.

В обеих группах на третьи сутки после некрэктомии и покрытия поверхности глазного яблока АМ, донорский материал сохранял плотное прилежание к поверхности глазного яблока и становился прозрачным. Больные отмечали уменьшение болей в глазу. В течение 8 –10 дней купировался воспалительный процесс, рассасывался гипопион, инфильтраты в строме роговицы. АМ рассасывалась в течение 15 – 21 дней. У всех больных наблюдалась быстрая эпителизация поверхности глазного яблока покрытой АМ. У больных c III степенью ожога и частичным поражением лимбальной области, эпителий формировался к 7- 12 дню послеоперационного периода. Цитологическое исследование у данных больных подтверждало регенерацию роговичного эпителия. У пациентов с IV степенью ожога во всех случаях поверхность роговой оболочки покрывалась конъюнктивальным эпителием. У всех пациентов покрытие АМ позволило избежать лизиса роговой оболочки, и частично сохранить конъюнктивальные своды.

Острота зрения при поступлении у большей части пациентов первой группы была на уровне правильного светоощущения. У одного пациента с IV степенью химического ожога при поступлении острота зрения – 0,01.

Во второй группе у пациентов с ожогом III степени была равна в среднем –0,05 (от правильного светоощущения до 0,3), у пациентов с ожогом IV степени –0,03 (от правильного светоощущения до 0,09).

При осмотре через 3 месяца у всех больных наблюдалось сформированное плотное бельмо, с единичными вновь образованными сосудами. Рецидива эрозии эпителия роговой оболочки, грубых деформаций конъюнктивальных сводов не наблюдалось. У пациентов с поражением более чем 2/3 диаметра лимбальной зоны  при цитологическом исследовании на поверхности роговой оболочки наблюдались клетки характерные для слизистой конъюнктивы.

Через три месяца после полученной травмы острота зрения в первой группе улучшилась с 1/p.l.c. до 0,01 у двух пациентов.

Во второй группе у пострадавших с ожогом III степени острота зрения через три месяца в большей части глаз увеличилась. Разброс значений остроты зрения был от 0,8 до светоощущения. В одном случае зрение ухудшилось с 0,03 до 0,01. На глазах с повреждением IV степени улучшение зрения получено только в одном случае с 0,09 до 0,5 у пациента с термическим ожогом. При этом очаг поражения располагался несколько эксцентрично, в нижнем наружном отделе. В остальных случаях зрение ухудшилось до светоощущения с правильной светопроекцией. Низкая острота зрения обусловлена временной блефароррафией и помутнением роговой оболочки.

Применение АМ с жизнеспособными клетками эпителиального слоя почти одинаково эффективно, как и применение силиковысушенной АМ. Однако хирурги отмечают сложность выкраивания и фиксации трансплантата из нативной АМ на поверхности глазного яблока.

Выводы. Высушивание над силикагелем укрепленной на рамках амниотической мембраны, без последующей фиксации на нитроцеллюлозной бумаге, позволяет упростить процесс консервации и сохранить уникальные биологические свойства донорского материала.

Эффективность регенерации эпителиальных тканей поверхности глазного яблока при использовании силиковысушенной амниотической мембраны без жизнеспособных клеток эпителиального слоя аналогична эффективности регенерации эпителиальных клеток при использовании амниотической оболочки с наличием жизнеспособных клеток.

При ожогах глаза покрытие АМ препятствует образованию грубых рубцов конъюнктивы, обеспечивает благоприятный внеклеточный матричный субстрат для эпителиальной миграции, способствует скорейшему восстановлению собственного эпителия, упрощает последующую визуальную реабилитацию.

 

Литература.

1.      Гулькевич Ю.В., Маккавеева М.Ю., Никифоров Б.И. Патология последа человека и ее влияние на плод. Минск Беларусь 1968; 232.

2.      Момозе А., Ксяо-Хонг К., Джунсуке А. Использование лиофилизированной амниотической оболочки человека для лечения поражений поверхности глазного яблока //Офтальмохирургия, 2001, №3. -С.3-9.

3.      Addsa P.J, Huntb C., Hartleyc S.  Bacterial contamination of amniotic membrane //Br J Ophthalmol 2001;85:228-230.

4.      Mejia LF, Acosta C, Santamaria JP.Use of nonpreserved human amniotic membrane for the reconstruction of the ocular surface. //Cornea. 2001 Oct;20(7):773-4.

5.      Panda A. Amniotic membrane transplantation in ophthalmology (fresh v. preserved tissue) //Br J Ophthalmol. 1999 Dec;83(12):1410-1.

6.      van Herendael BJ, Oberti C, Brosens I. Microanatomy of the human amniotic membrane: a light microscopic, transmission and scanning microscopic study. Am J Obstet Gynecol 1978;131:872-880.

7.      Xu L, Zhou S, Chen J, Chen L, Zhang M. A study on the preservation of fresh amniotic membrane. //Yan Ke Xue Bao. 2001 Sep;17(3):158-62.

<-Назад

 



© Copyright 2005 «Областная клиническая больница им. Ерошевского»
© Веб-дизайн: GxG, © Разработка: InternetElite